Le Flyer N° 23, Février 2006
 

Depuis Décembre 1994, date de création d’un ‘Centre Méthadone’ au sein du Centre Hospitalier Lyon-Sud, nous avons pris en charge les bilans urinaires de suivi des patients de cette structure. Puis, nous avons élargi notre recrutement en réalisant des analyses de deuxième intention, pour une confirmation de résultats, pour des patients pris en charge par des centres situés dans d’autres départements de la région Rhône-Alpes.

A ce jour, nous avons un recul lié à la réalisation de 6 000 analyses.

Nous limiterons cet article à la mise en évidence des opiacés et des médicaments de substitution, méthadone et buprénorphine, à l’origine des difficultés d’interprétation les plus fréquentes. Une interprétation correcte passant par une bonne connaissance du métabolisme de ces produits et des techniques utilisées par le laboratoire, ces deux volets seront abordés.

1.1. Métabolisme des opiacés

Fondamental pour une interprétation correcte des résultats, le métabolisme des opiacés est rappelé par le schéma ci-après. Deux points sont importants : la place centrale de la morphine qui est un métabolite commun à de nombreux opiacés, et la flèche à double sens entre codéine et morphine

Après administration digestive, nasale ou intra veineuse, la métabolisation des opiacés se fait au niveau du foie. La voie urinaire est la principale voie d’élimination et, hormis l’héroïne, les molécules citées ci-dessous sont toutes susceptibles d’être présentes dans les urines. On retrouve aussi les opiacés dans la sueur et la salive.
Durée de détection des opiacés dans le sang et les urines :

Après une absorption digestive la méthadone est métabolisée dans le foie par les enzymes de la famille des cytochromes P450. La variabilité individuelle des effets de la méthadone a pour origine, entre autres, la variabilité génétique des cytochromes avec, comme conséquence, des durées d’action extrêmement variables, pouvant aller de quelques heures à quelques jours. Aux valeurs extrêmes de ces durées d’action , il y a ce que l’on appelle les métaboliseurs lents et rapides.
Aux valeurs extrêmes de ces durées d’action , il y a ce que l’on appelle les métaboliseurs lents et rapides.
Au niveau hépatique la méthadone subit une N-déméthylation et une cyclisation.
Le métabolite cyclisé formé est le 2-Ethylidène-1,5-diméthyl-3,3-diphénylpyrrolidine (EDDP), il est inactif.
La voie urinaire est la principale voie d’élimination de la méthadone et de son métabolite. La méthadone est excrétée par filtration glomérulaire puis est réabsorbée par le tubule.

Si le pH urinaire augmente la réabsorption de la méthadone augmente, son élimination urinaire est moindre. Après administration d’une dose unique de méthadone, 20% sont excrétés dans les urines sous forme inchangée et 13% sous forme EDDP.

Une partie de la méthadone est excrétée via les fécès sous la forme EDDP.

On retrouve la méthadone dans la sueur et la salive.

Par ailleurs le métabolisme de la méthadone sera modifié en cas de prise conjointe d’un certain nombre de médicaments ou drogues, certains stimulant le système microsomial (carbamazépine, phénobarbital, rifampicine, antirétroviraux) et d’autres l’inhibant (fluvoxamine, fluoxétine, paroxétine, cimétidine…).

Comme pour la méthadone, ce sont les cytochromes P450 hépatiques qui interviennent dans la métabolisation de la buprénorphine et les mêmes remarques concernant la variabilité individuelle et les interférences médicamenteuses peuvent être formulées.
Au niveau hépatique, la buprénorphine subit une désalkylation et une conjugaison. Les trois métabolites formés, buprénorphine conjuguée, norbuprénorphine, et norbuprénorphine conjuguée sont inactifs.

L’élimination de la buprénorphine se fait majoritairement (70%) par la bile et les fécès.
Dans les urines on retrouve 25% de la dose absorbée, la norbuprénorphine conjuguée est le métabolite prédominant.

Le milieu biologique de routine pour le suivi des patients dépendants des opiacés traités par un produit de substitution reste l’urine.
Pour cela, deux raisons majeures :
- Après une prise unique de produit illicite, l’élimination urinaire s’étend sur deux à trois jours augmentant ainsi les chances de dépistage.
- Les concentrations urinaires en produits illicites ou en produits de substitution sont fortes et facilitent l’analyse technique.
Chez nos patients, c’est le milieu de choix pour mettre en évidence une éventuelle consommation d’opiacés et pour s’assurer de l’élimination conjointe de la méthadone et de son métabolite (ou de la buprénorphine).
Cependant l’urine est un milieu facile à frauder. Malgré des conditions de recueil strictes (absence de lavabo dans les toilettes, eau de la cuvette des WC colorée en bleu, recueil des urines dans un verre transparent) nous avons personnellement rencontré les problèmes suivants :
- Forte dilution des urines par boisson abondante dans l’heure qui précède la venue au centre
- Echange d’urines avec un autre patient du centre
- Utilisation d’une urine conservée pendant une période d’abstinence.

Le sang et la salive sont deux milieux biologiques qui présentent l’avantage de refléter l’imprégnation du patient au moment du prélèvement, et de ne pouvoir être fraudés par le patient. Pour faire la preuve qu’un délit ou crime a été commis sous l’emprise d’un produit illicite, la mesure de la concentration sanguine est nécessaire.

Les concentrations sanguines en opiacés sont faibles et fluctuantes, leurs mesures nécessitent la mise en oeuvre de techniques d’analyse lourdes. Dans le contexte du fonctionnement d’un centre méthadone, les mesures des concentrations sanguines en produits opiacés n’ont pas d’intérêt. Les concentrations sanguines en méthadone et en buprénorphine sont de mesure plus aisée, elles sont utiles pour faire le lien entre posologie de méthadone (ou de buprénorphine) et efficacité clinique obtenue.

La salive est une alternative à l’urine chez les sujets qui ont des difficultés à uriner, voire chez les sujets dialysés. Les concentrations salivaires sont du même ordre de grandeur que les concentrations sanguines

3.1. DANS LES URINES

3.1.A. VOLUME : Un volume d’urine de 10 ml est nécessaire et suffisant, pour permettre, si besoin, des investigations complémentaires.

3.1.B. VERIFICATION DE LA CONFORMITE DES URINES

pH : Le pH des urines est mesuré à l’aide d’un papier indicateur de pH par comparaison avec une échelle colorée. Le pH attendu est compris entre 5 et 6, un pH plus élevé (7 à 8) est parfois observé. En dehors de la fourchette 5 à 8 et si l’urine n’a pas « traîné », une adultération volontaire de l’urine est probable.

La mesure du pH est cotée B10 à la nomenclature et facturée 2,7 euros.

Créatinine : La créatinine urinaire est mesurée par la méthode de Jaffé. La concentration attendue en créatinine sur les urines d’une miction est variable mais reste comprise entre 8 et 35 mmo/l. Lorsque la concentration en créatinine est inférieure à 5 mmo/l, on peut affirmer que le patient a bu une grosse quantité d’eau dans l’heure qui a précédé le prélèvement ce qui entraîne une dilution physiologique de ses urines. Une telle dilution abaisse les concentrations de tous les constituants de l’urine et en particulier celle des opiacés : on risque alors des « faux négatifs ».
Couleur et odeur : Couleur et odeur de l’urine doivent être physiologiques
Recherche de produits chimiques adultérants : L’ajout de produits oxydants (javel, nitrites …) va perturber les méthodes du laboratoire. Il existe des bandelettes pour dépister ces additifs indésirables : Bandelette Adultacheck Société Dade Behring.

Le dépistage immunologique des opiacés est rapide et facile à réaliser.
Réalisé sur un automate de biochimie ou sur une plaquette à usage unique, le temps d’analyse est de l’ordre d’un quart d’heure. Mais il reste coûteux, coté B70 à la nomenclature des actes de Biologie médicale, il est facturé 19 euros.
Plusieurs sociétés proposent ce réactif : Dade Behring, Roche, Abbott, etc…

Une notion importante à connaître pour l’interprétation des résultats de dépistage en toxicologie est la notion de seuil. Le seuil d’une technique immunologique de dépistage des drogues correspond à la concentration de toxique que les sociétés savantes recommandent de prendre comme limite de positivité. Pour les opiacés le seuil est 300 ng/ml de morphine. Tous les fournisseurs de réactifs se conforment à ce seuil.

Le réactif clef du dépistage immunologique des opiacés est l’anticorps dirigé contre le noyau morphinane commun à tous les opiacés d’origine naturelle.

Cet anticorps réagit et dépiste toutes les molécules possédant ce noyau morphinane soit :
- Des opiacés illicites et leurs métabolites :
Héroïne, 6 Mono acétyl morphine
Morphine, Normorphine, Morphine                    glucuroconjuguée, codéine, Norcodéine, codéine glucuroconjuguée
- Des antitussifs banaux :
codéine , codéthylline, pholcodine

Mais cet anticorps ne réagit pas avec les molécules possédant un noyau morphinane modifié, celui des antalgiques morphinomimétiques d’usage volontiers détourné par les toxicomanes. La recherche est toujours négative avec ce type de réactif pour ces molécules :
Buprénorphine
Dextropropoxyphène
Péthidine
Dextromoramide
Tramadol
Méthadone

En conséquence l’interprétation de la recherche immunologique des opiacés reste délicate :
Une recherche d’opiacés négative signifie absence de consommation d’opiacés naturels si on est certain que l’urine n’a pas été fraudée, et si la créatinine est supérieure à 5 mmol/l.
Une recherche d’opiacés positive ne fait que poser la question « consommation de produits illicites ou d’antitussifs ? ». Elle nécessite une analyse chromatographique complémentaire pour identifier la molécule dépistée ou, a minima, une analyse immunologique complémentaire de recherche spécifique de 6 mono-acétyl-morphine (laboratoire Microgénics).

Le point clef est toujours le réactif anticorps et la spécificité de l’anticorps.
L’autre point important est le milieu dans lequel peut se dérouler la réaction immunologique, soit le milieu est entièrement liquide (méthodologie EMIT, CEDIA ou FPIA), soit la réaction immunologique se fait sur un support solide avec des étapes de lavages intermédiaires (méthodologie ELISA). Dans le premier cas (milieu liquide) la technique est rapide automatisable et bien adaptée à la réalisation de petites séries fréquentes, dans le deuxième cas la technique est longue (minimum deux heures) et convient pour les grandes séries d’analyse.

Pour la méthadone :
Il existe un anticorps spécifique de la méthadone (qui ne reconnaît pas le métabolite) et un anticorps spécifique du métabolite EDDP (qui ne reconnaît pas la méthadone).
Il existe des techniques EMIT pour la méthadone (Société Dade Behring, Roche, Abbott…) et pour l’EDDP (Société Microgénics).
Les méthadonuries mesurées chez nos patients s’étagent entre 0,3 mg/l, limite de détection de la méthode et 50 mg/l lorsque les urines sont concentrées (Créatininurie >30 mmol/l). Les méthadonuries témoignent de la compliance au traitement mais ne permettent pas une adaptation de posologie.

S’il faut choisir entre recherche de méthadone ou d’EDDP il faut privilégier l’EDDP car :
- Certains sujets fournissent une urine vierge additionnée de solution de méthadone : l’absence de métabolite révèle immédiatement cette fraude.
- Dans les cas où les urines émises sont alcalines, la méthadone est réabsorbée en plus grande quantité et peut être parfois absente de l’urine, l’EDDP est toujours présent.

Pour la buprénorphine :
L’anticorps est spécifique de la buprénorphine. La buprénorphine et la buprénorphine conjuguée sont reconnues par l’anticorps. La norbuprénorphine et son conjugué, métabolites majoritaires, ne sont pas reconnus.
Il existe des techniques ELISA pour la buprénorphine (Société Cozart, Société Microgénics) et une technique CEDIA (Société Microgénics).
Ces méthodes immunologiques permettent de savoir si les patients consomment ou non du Subutex® et pour cela, le seuil de positivité proposé est de 5 ng/ml.
Les urines trouvées positives peuvent être, si nécessaire, confirmées et quantifiées par une méthode séparative HPLC avec détection électrochimique ou UV ; ces techniques sont utiles pour mettre en évidence les métabolites en cas de suspicion de fraude.

La séparation des molécules présentes dans les urines est réalisée grâce à la différence de vitesse de déplacement à l’intérieur d’une colonne chromatographique remplie par une phase stationnaire parcourue par un gaz ou un liquide vecteur.
Le résultat final est un chromatogramme, présentant autant de pics que de molécules - opiacés et autres - présentes dans les urines ; chaque pic ou molécule est ensuite identifié à l’aide de son temps de rétention (lié à sa vitesse dans la colonne) et son spectre dans l’ultra-violet ou son spectre de masse.
La méthode séparative chromatographique est de réalisation longue et délicate. Elle est coûteuse en temps technique. Le délai de rendu du résultat est de l’ordre de la demi-journée Cotée B 250 à la nomenclature des actes de Biologie médicale, elle est facturée 67,5 euros. L’interprétation des tracés exige une compétence acquise avec l’expérience.
Plusieurs sociétés (Biorad, Waters, Agilent…) commercialisent des systèmes de chromatographie en phase gazeuse (GC) ou de chromatographie en phase liquide haute pression (HPLC), ces systèmes sont équipés de détecteur de masse (MS) ou ultra-violet (UV).

Pour les opiacés, la valeur ajoutée par une méthode séparative est la suivante :
Présence de 6 MAM : Certitude de prise récente d’héroïne
Présence de Morphine > Codéine : Présomption forte de prise d’héroïne datant de plus de 12 h ou de morphine ; mais n’exclut pas une prise ancienne de codéine
Présence de Morphine < Codéine : Présomption de prise récente de codéine
Présence de Morphine < Codéthyline : Prise de codéthyline
Présence de Morphine < Pholcodine : Prise de pholcodine
Présence d’alcaloïdes du pavot (thébaïne, noscapine, paravérine) : Prise d’opium
Pour la méthadone, comme pour la buprénorphine, les méthodes séparatives qui permettent de visualiser produit parent et métabolite sont bien sûres idéales.

3.1.E. En conclusion, le choix conseillé serait :

- sans équipement chromatographique : EDDP – Buprénorphine – opiacés (et si cette recherche est positive recherche de 6 mono-acétyl-morphine)
- avec équipement chromatographique : analyse chromatographique en première ligne

3.2.A. VOLUME ECHANTILLON :

10 ml de sang prélevés sur tube sans anticoagulant sont nécessaires

3.2.B. METHODES IMMUNOLOGIQUES :

Pour les opiacés, les méthodes immunologiques ne sont pas adaptées, en effet avec les kits du marché le seuil de positivité à 300 ng/ml de morphine place la barre du dépistage positif trop haut pour détecter les faibles concentrations opiacés sanguines.
Pour la méthadone, les méthodes immunologiques dédiées aux urines conviennent car les concentrations sanguines en méthadone sont comprises dans la gamme de mesure de la technique (entre 0 et 1000 ng/ml).
Pour la buprénorphine, comme pour la méthadone, les méthodes immunologiques conviennent, les concentrations sanguines en buprénorphine sont comprises dans la gamme de mesure de la technique (entre 0 et 10 ng/ml).

3.2.C.METHODES CHROMATOGRAPHIQUES SEPARATIVES
Le principe et les indications sont les mêmes pour les opiacés, la méthadone et la buprénorphine.
Les méthodes employées seront les méthodes chromatographiques séparatives décrites pour l’urine avec une étape supplémentaire : l’étalonnage à l’aide de solutions de concentrations connues et certifiées en 6 mono-acétyl-morphine, morphine, codéine, méthadone et buprénorphine.
Seuls, quelques laboratoires en France effectuent ces dosages dans le sang. Certains sont habilités à les effectuer sur réquisition de la justice. Le délai de rendu des résultats est de l’ordre de la semaine.
Plus longues délicates et coûteuses que la recherche dans les urines, cette méthode est cotée B 400 à la nomenclature des actes de Biologie médicale soit 108 euros.
3.2.D. EN CONCLUSION
Pour la méthadone et la buprénorphine, les méthodes immunologiques ont des performances suffisantes pour nos patients.

3.3.A. VOLUME ECHANTILLON
Un millilitre de salive prélevé avec un dispositif spécifique (type salivette) suffit. Le prélèvement est à faire avant la prise de méthadone ou de buprénorphine pour éviter toute contamination.

3.3.B. METHODES IMMUNOLOGIQUES
Pour la méthadone et la buprénorphine ces méthodes sont utilisables et adaptées puisque la salive est le reflet du sang (on ne retrouve pas le problème des métabolites urinaires)

La sensibilité des trousses est correcte pour ces substances.

3.3.C. METHODES SEPARATIVES
Elles n’ont pas d’intérêt dans notre contexte où la salive est l’alternative à l’urine lorsque le prélèvement urinaire est impossible.

La recherche dans les urines est largement passée en pratique courante ; d’abord au moment de la prise en charge d’un nouveau patient pour s’assurer qu’aucun traitement substitutif n’est pris à l’insu du praticien, puis chez un patient traité pour s’assurer de la bonne observance du traitement de substitution.

Le dosage dans le sang n’est pas suffisamment prescrit malgré les nombreuses circonstances d’indications, par exemple :

- Pour justifier une augmentation de posologie chez un patient qui continue à consommer des produits illicites.
- Pour s’assurer que la concentration sanguine en produit de substitution ne se situe pas dans une zone toxique.
- Pour convaincre un patient réticent à augmenter sa posologie.
- Pour repérer les métaboliseurs rapides dont le taux sanguin à 12 heures de la prise est insuffisant et conseiller alors une prise matin et soir.

- Pour repérer des métaboliseurs lents et expliquer des signes de surdosage inattendus, ou plus généralement des effets secondaires liés à une accumulation de méthadone (hypersudation, hypersomnie…).
- Chez une femme enceinte pour adapter la posologie à ce nouvel état physiologique.
- En cas d’induction ou d’arrêt d’un traitement potentiellement modificateur du métabolisme du produit de substitution.
- Au final pour améliorer et individualiser la prescription. Mais, ces dosages sanguins ne doivent pas non plus être prescrits à n’importe quel moment, il est nécessaire d’attendre au moins un mois après le début de l’instauration du traitement et au moins cinq jours après un changement de posologie.

Le prélèvement doit être fait juste avant la prise de méthadone ou de buprénorphine. Compte tenu de la variabilité individuelle pour ces traitements, on peut conseiller de faire un prélèvement sanguin « témoin », correspondant pour le patient à une période de stabilité, ce qui permettrait d’avoir un point de repère lorsque les dosages sanguins deviennent nécessaires.

Inférieur à 200 ng/ml : Inefficacité thérapeutique, Signes de manque probables
200 à 400 ng/ml : Peu ou disparition des signes de manque, Blocage incomplet des récepteurs opiacés

400 à 500 ng/ml : Dosage optimal, en général plus de signes de manque, Blocage des récepteurs opiacés effectif

500 à 700 ng/ml : Signes de manque improbables, Surveillance clinique, Risque d’overdose
Supérieur à 700 ng/ml : Signes de manque improbables, Rechercher les raisons d’une posologie/méthadonémie élévée, Surveillance clinique, Risque d’overdose

Nous avons récemment revu à la hausse notre fourchette de méthadonémie. Désormais l’objectif à atteindre se situe entre 400 et 600 ng/ml.

Il y a peu de corrélation entre les concentrations sanguines de buprénorphine et l’efficacité clinique. Ceci s’explique par le volume de distribution important de la buprénorphine et sa liaison prolongée aux récepteurs opiacés.

 

A l’équilibre, les concentrations sanguines obtenues chez les patients traités par la buprénorphine haut dosage sont comprises entre 1 et 10 ng/ml. Le dosage sanguin est indiqué en cas d’inefficacité inexpliquée ou d’intoxication suspectée.

La contribution du laboratoire à la prise en charge des patients traités par méthadone ou buprénorphine nécessite une étroite collaboration clinico-biologique pour adapter l’étude analytique des échantillons biologiques aux problèmes posés par le patient.

En règle générale, le laboratoire utilise des méthodes immunologiques et/ou séparatives dont il faut bien connaître les limites pour une bonne exploitation des résultats.